本作的单机模式有九个章节，故事情节紧接二代末尾，不仅马里奥大叔与达芬奇这样的老面孔会登场，还有历史上的著名人物马基雅维利助阵，剧情的走向也对系列的发展至关重要。游戏的一开始还将系列前两作的剧情做了一个简要的交代，即使是没有玩过前两作的玩家也能对剧情有所了解。